Son père était propriétaire terrien. Le médecin Gui Patin, professeur au Collège de France à l’époque de Mazarin, est un ancêtre de la famille.
Eugène Lefébure se marie une première fois et perd sa femme très tôt. Il se remaria en 1876 et aura deux enfants : Edmond, mort à Alger en 1890, et Maurice qui deviendra médecin.
Eugène Lefébure a étudié aux collèges d’Auxerre et de Sens et a été le disciple de F.-J. Chabas en égyptologie.
Eugène Lefébure a été maître de conférences à l’EPHE, Section des Sciences religieuses de 1886 à 1887 : « Religions de l’Égypte ».
Eugène Lefébure a été employé dans l’administration des postes (finissant au grade de receveur) de 1858 à 1879, à Saint-Germain en Laye, Paris et Lille, et maître de conférences à la Faculté des Lettres de l’Université de Lyon de 1879 à 1881 et de 1883 à 1884. Il a dirigé la Mission archéologique française au Caire de 1881 à 1883. Il a été également le suppléant de Gaston Maspero à la chaire d’égyptologie du Collège de France de 1884 à 1885 et professeur d’égyptologie à l’École Supérieure des Lettres d’Alger de 1887 à 1908.
Eugène Lefébure était un ami très proche de Stéphane Mallarmé, et écrivit aussi quelques poèmes publiés dans le Parnasse contemporain en 1866.
Eugène Lefébure fait partie des premiers membres de la Mission archéologique française au Caire qui deviendra l’Institut français d’archéologie orientale. À ce titre, il eut une activité féconde en Égypte, publiant pour la première fois les tombes royales de Séti Ier et de Ramsès IV dans la Vallée des rois à Louqsor. Mais le travail d’épigraphiste ne fut pas sa seule vocation ; poète parnassien à ses heures, maître de Mallarmé aux dires de ce dernier, il s’intéressa également au fétichisme et est considéré de ce fait par certains comme un ancêtre de la psychanalyse.
- Traduction comparée des hymnes au soleil composant le XVe chapitre du rituel funéraire égyptien, Paris, 1868.
- Le mythe osirien I. Les yeux d’Horus, Études égyptologiques 3, Paris, 1874.
- Le mythe osirien II. Osiris, Études égyptologiques 4, Paris, 1875.
- Les hypogées de Thèbes, Mémoires publiés par les membres de la Mission archéologique française au Caire 2-3, Paris, 1886-1889, 1. Le tombeau de Séti Ier ; 2. Notice des hypogées ; 3. Tombeau de Ramsès IV.
- Œuvres diverses, 3 vol., Bibliothèque Égyptologique 34-36, Paris, 1910-1915.
Publiés sous la direction de Gaston Maspero, ces volumes reprennent de très nombreux articles de Lefébure parus dans diverses revues, dont :
- « L’Égypte ancienne : discours prononcé à l’ouverture des conférences d’archéologie égyptienne à la Faculté des Lettres de Lyon le 26 avril 1879 », Bibliothèque égyptologique 34, Paris, 1910, p. 133-150.
- « L’étude de la religion égyptienne. Son état actuel et ses conditions. Introduction à un cours sur la religion de l’Égypte à l’École des Hautes Études (Section des Sciences religieuses) », Bibliothèque égyptologique 34, Paris, 1910, p. 329-359 ».
- « Rites égyptiens. Construction et protection des édifices », Bibliothèque égyptologique 35, Paris, 1912, p. 41-146.
E. Andersonn, Sphinx 12, 1909, p. 1-13 ; H. Mondor, Eugène Lefébure. Sa vie – Ses lettres à Mallarmé, Paris, 1951 ; W. Dawson et E. Uphill, Who was Who in Egyptology, 3ème éd., Londres, 1995, p. 243-244 ; C. Beinlich-Seeber, Bibliographie Altägypten 1822-1946 I, Ägyptische Abhandlungen 61/2, Wiesbaden, 1998, p. 986-992.